shkolakz.ru   1 2 3 ... 10 11

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Среди иммунологических методов диагностики антител в ревматологии наибольшее распространение получили иммуноферментный (ИФА) и иммунофлуоресцентный (ИФЛ) методы анализа. Опираясь на данные, полученные в ходе наших ранних исследований о том, что классические варианты ИФА и ИФЛ не позволяют в должной мере оценить процессы антителогенеза к ферментам АОС и ПМ у больных РА, нами предварительно был проведен сравнительный анализ ИФА и ИФЛ на основе ИГАП с использованием иммобилизированных ферментов в качестве антигенной матрицы. Была продемонстрирована корреляция высокой силы между двумя способами определения антител (r=0,764; p<0,001). Однако 6,7% образцов в контрольной группе (здоровые лица) были отнесены к позитивным при использовании ИФЛ, а 4,2% образцов сыворотки крови больных РА, которые были положительными в ИФА, оказались отрицательными при проведении иммунофлуоресцентного анализа.

Учитывая однонаправленность выявленных закономерностей, а также техническую оснащенность каждой конкретной лаборатории, можно рекомендовать для применения оба метода, отдавая предпочтение, тем не менее, иммуноферментной методике как более чувствительной. Принимая во внимание бóльшую трудоемкость ИФЛ, в качестве предпочтительной методики нами был выбран метод ИФА.

На следующем этапе для выбора предпочтительного варианта иммуноферментного метода определения Ат к ферментам был проведен сравнительный анализ методики ИФА, основанной на использовании микротитрационных планшетов (классический вариант ELISA-теста), и варианта ИФА с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов (ИГАП).

При постановке иммуноферментного анализа с использованием ИГАП наблюдалось как повышение аффинности, связанное с разделением фаз и повышением локальной эффективной концентрации связывающих участков антигена на разделе фаз, так и существенное увеличение концентрации антигена при уменьшении объема реагентов. Кроме того, помещение гранул с магнитными свойствами в переменное магнитное поле вызывает перемещение фаз друг относительно друга, в результате чего вероятность встречи антигенраспознающего центра антител, находящихся в жидкой фазе, с антигеном, фиксированном на твердой фазе, повышается. Также этим достигается перемешивание компонентов системы, предотвращающее неравномерность распределения компонентов в растворе. Таким образом, реакция антиген – антитело смещается в направлении образования комплекса.


Таким образом, учитывая, что модифицированная методика иммуноферментного анализа с использованием ИГАП имеет очевидные преимущества перед методиками, использующими в качестве твердой фазы полистироловый планшет, при проведении исследований, направленных на изучение процессов антителогенеза к ферментам АОС и ПМ, предпочтение было отдано ИФА с иммобилизированными антигенными препаратами.

В качестве антигенов использовались коммерческие препараты исследуемых ферментов производства фирмы «Sigma» (США): препарат супероксиддисмутазы из эритроцитов человека (Superoxide Dismutase from human erythrocytes; Cat. № S 9636); препарат глутатионредуктазы (Glutathione Reductase from Bakers yeast; Cat. № G 3664); препарат каталазы из эритроцитов человека (Catalase from human erythrocytes; Cat. № C 3556); препарат аденозиндезаминазы из печени быка (Adenosine Deaminase from bovine spleen, Cat. № А 5043); препарат 5'-нуклеотидазы из яда гремучей змеи (5'-Nuc­leotidase from Crotalus atrox venom; Cat. № N 5880); препарат пуриннуклеозидфосфорилазы из крови человека (Nucleoside Phosphorylase from human blood; Cat. № N 3514); препарат гуаниндезаминазы из печени кролика (Guanase from rabbit liver; Cat. № G 5752); препарат ксантиноксидазы микробного происхождения (Cat. № Х 2252). Также был использован коммерческий препарат "Церулоплазмин диагностический очищенный жидкий человеческий" серия 1 К 118 (Предприятие по производству бакпрепаратов НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия).

Для получения иммобилизированных форм изучаемых ферментов использовали растворы с соответствующей концентрацией: для СОД – 1,4 мг/мл, для ГР – 1,6 мг/мл, для ЦП – 0,75 ммоль/л, для КАТ – 1,4 мг/мл, для АДА – 100 мкг/мл, для 5'-НТ – 100 мкг/мл; для ПНФ – 50 мкг/мл; для ГДА – 20 мкг/мл, для КО – 50 мкг/мл.

Учитывая достаточную относительную молекулярную массу используемых в исследовании ферментов (ГР – 50-55 кДа, ЦП – 132 кДа, КАТ – 240 кДа, АДА – 36 кДа, 5'-НТ – 60-120 кДа; ПНФ – 90-92 кДа; ГДА – 100-120 кДА; КО – 300 кДа), иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в модификации И.П.Гонтаря с соавт. (1999 г.) в потоке газообразного азота с включением в структуру гранул магнитного материала. Беря во внимание небольшую относительную молекулярную массу эритроцитарной СОД ( 30 кДа) иммобилизацию фермента проводили путем пришивки его молекулы глютаровым альдегидом к инертной полиакриламидной грануле, содержащей магнитный материал. Иммобилизацию осуществляли по методу, описанному A.С.Johansson et all. (1974). Было определено, что максимальная сорбция СОД на гранулы, активированные глютаровым альдегидом, составила 980 мкг белка на 1 мл (70%). По завершению полимеризации гранулы с иммобилизированным ферментом в течение 15-20 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом (0,05% твин-20) от не прореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана.


В итоге были получены ИГАП, представляющие собой двойные полиакриламидные гранулы правильной сферической формы с размером частиц от 10 до 100 мкм. Средний диаметр гранул составил 55±6,8 мкм (соотношение полимерный носитель : железо 2:1, в пересчете на сухую массу). ИГАП имели длительный срок хранения (до 2-х лет); после регенерации они были пригодны для повторного использования.

Для определения показателя индекса авидности (ИА) изучаемых антител также был применен иммуноферментный анализ. В качестве денатурирующего вещества использовали 8М раствор мочевины. Выявление в испытуемой сыворотке антител с индексом авидности ниже 30% расценивалось как низкий уровень авидности. Показатель авидности, равный или превышающий 50%, свидетельствует о наличии в сыворотке высокоавидных антител. Показатель авидности антител в интервале 31-49% расценивался как неопределенный.

С диагностической целью, а также для оценки корреляции с изучаемыми показателями был проведен целый ряд иммунологических проб, позволяющих охарактеризовать иммунный статус больных РА. Методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини определяли различные классы иммуноглобулинов (A, G, M). Ревматоидный фактор выявляли с помощью теста латекс агглютинации. Циркулирующие иммунные комплексы определяли методом преципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskova в модификации Б.А.Лемперта. Определение антинуклеарного фактора по Кунсу проводилось методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием в качестве субстрата криостатных срезов печени белой крысы в качественном варианте с выделением типа и интенсивности свечения.

Активность изучаемых ферментов определялась в сыворотке крови: эритроцитарной СОД по методу Чевари С. и соавт. (1985), плазменной СОД по методу Дубининой Е.Е. и соавт. (1986).; глутатионредуктазы по методу Ченас Н.К. (1989); каталазы по методу Коробейниковой Э.Н. (1989); церулоплазмина по методу Ravin H.A. в модификации Тена Э.В. (1981); аденозиндезаминазы по методу Martinek R.G. (1963); 5-нуклеотидазы по методике Wood R. и Williams D. (1981); пуриннуклеозидфосфорилазы по методике Robertson B.C. и Hoffe P.A. (1973); гуаниндезаминазы по методике Caraway W.T. с использованием цветной реакции Бертелота (1966); ксантиноксидазы (О-форма) по методике Kalckar H.M. в модификации Дячиной Е.Г. (1973) и ксантиндегидрогеназы (D-форма) по методу Devenyi Z.J. et all. (1987).


Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программных пакетов «STATISTICA 6.0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA) и SPSS (SPSS for Windows, Release 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA), а также по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах. Представление описательных статистик и выбор статистических критериев производились исходя из цели исследования, решаемых при этом задач и рекомендаций руководств по биостатистике.

На основе модели приближенных отношений и методов вывода по прецедентам совместно с сотрудниками кафедры Программного обеспечения автоматизированных систем Волгоградского Государственного Технического Университета (кандидат технических наук, доцент О.А. Сычев; доктор технических наук, профессор А.М. Дворянкин) был разработан программно-информационный комплекс поддержки диагностики ревматических заболеваний. Комплекс прошел опытную эксплуатацию в НИИ Клинической и Экспериментальной Ревматологии РАМН в 2005-2008 гг. Эффективность комплекса изучалась при диагностике формы, активности и течения ревматоидного артрита по данным лабораторных исследований (16 типов симптомов). Обучающую выборку составили 78 больных ревматоидным артритом с диагнозом, подтвержденным в течение длительного времени, контрольную выборку – 25 человек.



<< предыдущая страница   следующая страница >>