shkolakz.ru 1

www.diplomrus.ru ®

Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок


Содержание

ВВЕДЕНИЕ...7


ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...11


1. ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ И ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ...11


1.1. КА ТИОННЫЕ АЗИНИЕВЫЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗА ТОРЫ...22


1.2. МАКРОЦИКЛИЧЕСКИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ...26


1.3 5-АМИНОЛЕВУЛИНОВАЯКИСЛОТА...33


2. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ В "БЫСТРОЙ МИКРОБИОЛОГИИ"...38


2.1. МЕТОДЫ "БЫСТРОЙМИКРОБИОЛОГИИ"...38


2.2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ А ТФ КАК ИНДИКА ТОР ПРИСУТСТВИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК В РАЗЛИЧНЫХ ОБРАЗЦАХ...39


2.3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ...40


2.4. МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО АТФ...42


2.4.1. ЭКСТРАГЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В АТФ-МЕТРИИ...42


2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АТФ В РАЗЛИЧНЫХ ОБРАЗЦАХ...47


2.5.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ (ПУЛА) АТФ 47


2.5.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОМАТИЧЕСКОГО АТФ...47


2.5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНОГО АТФ...48


2.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ОБРАЗЦОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ...53


ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...56


1. ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И МАТЕРИАЛЫ...56


2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...57

3. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ АППАРАТУРА...58


4. МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ...62


4.1. ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА БИОМАССЫ...62


4.2. ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИАТФ...63


4.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФОТОВОЗДЕЙСТВИЯ НА УРОВЕНЬ СОДЕРЖАНИЯ АТФ В КЛЕТКАХ...67


4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНЫХИНГИБИРУЮЩИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ...68


4.5. ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МИКРОБНЫХ КЛЕТОК 69

4.6. ИЗМЕРЕНИЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ КЛЕТОК E.COLI IN VIVO.70 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...72



1. ВЫТЕКАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО АТФ ИЗ КЛЕТОК SACCHAROMYCESCEREVISIAEИESCHERICHIA COLILE 392 ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ НА НИХ ВОЗДЕЙСТВИИ...72


1.1. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ АТФ В ИССЛЕДУЕМЫХ КЛЕТКАХ...72


1.1.1. ОБЛУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ, НЕ СОДЕРЖАВШИХ СЕНСИБИЛИЗАТОРА...72


1Л .2. ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ТЕМНОВОЙ ИНКУБАЦИИ КЛЕТОК С ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОМ...73


1.1.3. ПРИРОДА БУФЕРНОГО РАСТВОРА И РН СРЕДЫ...77


1.1.4. КОНЦЕНТРАЦИЯ СЕНСИБИЛИЗАТОРА...85


1.1.5. ДОЗА ОБЛУЧЕНИЯ И ПУТИ ЕЕ ДОСТИЖЕНИЯ...87


1.2. ВЛИЯНИЕ ФАЗЫ РОСТА НА ФОТО ДИНАМИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ... 91


1.3. ФОТОДЕСТРУКЦИЯ КАК МЕТОД ЭКСТРАКЦИИ АТФ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АТФ-МЕТРИИ...94


1.4. ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК E.COLI PLR IN VIVO...97


2. ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГРАМ-ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ И ГРАМ-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ (НА ПРИМЕРЕН. COLIО157:Н7 ИL. MONOCYTOGENESХМ 353)...103


2.1. БАКТЕРИЦИДНЫЙ ЭФФЕКТ MB, ТВО И TMPYP НА Е. COLI O157:H7HL. MONOCYTOGENES LM 353 И МИНИМАЛЬНЫЕ ИНГИБИРУЮЩИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ...103


2.2. ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ ВНУТРИ- И ВНЕКЛЕТОЧНОГО АТФ В Е. COLI О157.Н7 И L. MONOCYTOGENES LM 353...108


ВЫВОДЫ...121


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...122

Введение


СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТРИВИАЛЬНЫХ НАЗВАНИЙ


АДФ АМФ АТФ


ати


внекл.


ДАБЦО


димигин


ДМСО


ДТАБ


ед.


КЖ


кл.


КОЕ


конц.


люциферин


мик


об.


ТБК


ТХУ


у.е.


усл.


ФАХТ

ФДТ



ФМН


ФМНхН2


цпм


ЦТАБ ЭДТА


аденозиндифосфат


аденозинмонофосфат


аденозинтрифосфат


атмосфера избыточная


внеклеточный


диазобициклооктан


2,4-ди(а-метоксиэтил)дейтеропорфирин - IX


диметил сул ьф оксид


додецилтриметиламмония бромид


единица


культуральная жидкость


клетка


колонеобразующая единица


концентрация


0-(-)-2-(6-оксибензтазолил-2)-3,4-дигидротиазолил-4-карбоновая кислота


минимальная ингибирующая концентрация


обороты


тиобарбитуровая кислота


трихлоруксусная кислота


условные единицы


условный


фотодинамическая антимикробная химиотерапия


фотодинамическая терапия


флавинмононуклеотид


флавинмононуклеотид (восстановленная форма)


цитоплазматическая мембрана


цетилтриметиламмония бромид


этилендиаминотетрауксусная кислота


ALA - 5-аминолевулиновая кислота


AIPcS2 - дисульфированный фталоцианин гидроксиалюминия


DP - дейтеропорфирин


ЕС - энергетический заряд


HEPES - Т\К2-гидроксиэтил)пиперазин-№ -(2-этансульфоновая кислота)


HP - гематопорфирин


HPD - дериват гематопорфирина


LB - питательная среда Лурия-Бертани


MB - метиленовый синий


]О2 - синглетный кислород


PBS - 0,01 М фосфатный буферный раствор


РсАЮН - хлорид окта-4,5-карбо-(2-оксиэтил-триметиламмоний) фталоцианина оксиалюминия


РР - протопорфирин

RLU - относительные световые единицы



ТВО - толуидиновый синий О


ТЕЮНРуР — хлорид мезо-тетра(4-ТчГ-гидроксиэтил-пиридил)порфина


ТМРуР - тозилат мезо-тетра(4-1Ч-метшызиридил)порфина


е — коэффициент экстинкции


Хтах — длина волны максимума поглощения света


ВВЕДЕНИЕ


Первичным процессом фотобиологических реакций является поглощение света молекулами вещества. В большинстве случаев эти молекулы представляют собой биологический субстрат, который сам претерпевает дальнейшие фотохимические изменения. В некоторых случаях в качестве первичных акцепторов световой энергии выступают вещества, которые передают эту энергию на другие молекулы, а сами при этом обычно не претерпевают химических превращений. Такие вещества называют фотосенсибилизаторами, а процессы, в которых они участвуют, -фотосенсибилизационными [1]. В качестве сенсибилизатора в клетках могут выступать как естественные метаболиты - хлорофилл, флавины, порфирины, билирубин (эндогенные сенсибилизаторы), так и широкий круг попадающих в клетки экзогенных веществ - акцепторов видимого света (красители, ароматические углеводороды). Частным случаем фотосенсибилизированных процессов является фотоповреждение биологических систем в присутствии сенсибилизаторов с участием молекулярного кислорода — так называемое фотодинамическое действие.

Повышенный интерес к фотосенсибилизируемым процессам в настоящее время обусловлен рядом практических задач, которые можно разбить на две группы. Первая включает разработку защитных мер от сенсибилизированного фотоповреждения. Создание мощных источников света и повышение уровня загрязненности окружающей среды увеличивают вероятность фотоповреждений с участием экзогенных сенсибилизаторов (например, рак кожи). С другой стороны, в организме всегда находится определенное количество эндогенных сенсибилизаторов, например протопорфирина. При наследственном заболевании эритропоэтическая протопорфирия в эритроцитах больных накапливается большое количество протопорфирина, что приводит к сенсибилизированному фотоокислению мембранных компонентов и гемолизу клеток.



Вторая группа задач связана с разработкой и усовершенствованием способов направленного фотоповреждения клеток и биологических структур. Например, весьма заманчивой является возможность стимулирования иммунной системы организма при небольших фотосенсибилизированных повреждениях компонентов крови. Вероятно, именно таким стимулированием объясняется терапевтическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения [2]. Но, в первую очередь, к этой группе относится разработка способов фоторадиационной терапии опухолей - разрушение клеток опухоли видимым светом в присутствии сенсибилизаторов, которые могут избирательно накапливаться в опухолевой ткани. В последние десятилетия были достигнуты серьезные успехи в таком альтернативном лечении опухолей, используя порфириновые производные и облучение лазерном светом [3]. Сочетание фотосинтезирующих препаратов и света приводит к появлению в опухолевом окружении реакционно-способных производных кислорода, приводящих к гибели опухоли. Данное явление известно как фотодинамическая терапия (ФДТ). По этой причине большинство встречающихся в литературе работ, связанных с изучением фотодинамического действия, были посвящены фоторазрушению клеток млекопитающих. Однако в последние годы возрос интерес исследователей к фотодинамическому повреждению бактериальных клеток -фото динамической антимикробной химиотерапии (ФАХТ) [4]. В основном это связано с необходимостью поиска новых путей стерилизации зараженных объектов и лечения микробных инфекций из-за быстрых эволюционных изменений в природе, приводящих к появлению широкого разнообразия антибиотико-устойчивых патогенных штаммов. С другой стороны, необходимо учитывать, что в большинстве стран с развивающейся рыночной экономикой (включая и Россию) финансирование систем здравоохранения и санитарно-эпидемиологического контроля находится на довольно низком


уровне. Это также требует поиска новых более дешевых антимикробных агентов.

Из литературы также известно, что основной мишенью фотодинамического повреждающего действия, как правило, является клеточная мембрана [5-7]. Это позволило предположить, что данное явление может быть использовано в методе биолюминесцентного определения концентрации клеток [8] в качестве альтернативного пути экстракции внутриклеточного АТФ для увеличения его чувствительности и точности. Дело в том, что при определении концентрации АТФ биолюминесцентным методом, микробные клетки предварительно разрушают, используя различные экстрагенты [9, 10]: кислоты, растворители или поверхностно-активные вещества. Светляковая люцифераза, используемая в биолюминесцентном анализе АТФ, довольно сильно ингибируется такими экстрагентами [11]. Для уменьшения ингибирующего действия образец приходится разбавлять. Следует также учитывать, что наибольшая эффективность разрушения клеточной мембраны достигается при высоком отношении объема экстрагента к объему пробы, что, естественно, сильно уменьшает концентрацию АТФ в образце. Эти обстоятельства приводят к снижению чувствительности метода. Кроме того, данный метод позволяет количественно определить в первую очередь общую зараженность образца, но не зараженность определенным видом микроорганизмов. Определение же специфической обсемененности на фоне общей микробной зараженности объекта требует дополнительные подходы, приводящие к существенному усложнению методик и увеличению времени анализа [12]. Тот факт, что сенсибилизаторы различного строения могут по-разному взаимодействовать с микроорганизмами с различным строением клеточной стенки [4, 13], открывает перспективу селективного определения и стерилизации бактерий одного типа на фоне других.


Целью настоящей работы являлось выявление особенностей фотодинамического воздействия различных сенсибилизаторов на клетки микроорганизмов с разным строением клеточной стенки:


1) изучение процесса вытекания АТФ из дрожжевых и Грам-отрицательных клеток в зависимости от разных факторов в свете выяснение возможности использования данного явления как альтернативного метода экстракции внутриклеточного АТФ в биолюминесцентной АТФ-метрии;


2) проведение сравнительной характеристики некоторых фотоагентов по их влиянию на жизнеспособность Грам-отрицательных и Грам-положительных микроорганизмов в свете применения фотодинамического воздействия как способа стерилизации зараженных микробами объектов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ


1. ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ И ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ


Когда ароматическая молекула поглощает свет определенной энергии, она может подвергаться электронному переходу в синглетное возбужденное состояние (спины электронов спарены). Затем (в зависимости от молекулярной структуры и окружения) молекула может потерять свою энергию под действием электронных или физических процессов, возвращаясь таким образом в основное состояние, или же перейти в триплетное возбужденное состояние (спины электронов распарены). На этом этапе молекула может снова вернуться в основное состояние, вступить в окислительно-восстановительные реакции со своим окружением, или передать энергию возбуждения молекулярному кислороду (тоже триплетной молекуле) с образованием лабильного синглетного кислорода ('С^) (рис. 1).


Синглетным кислородом называют электронно-возбужденные молекулы Ог, находящиеся на одном из синглетных уровней ( '?+g и !Ag) [14]. Таким образом, !Ог отличается от других активных форм кислорода (радикалы 'CV, НО2\ ОН* или перекись водорода) тем, что для его получения требуется лишь поглощение энергии без химической модификации кислородных молекул.

Вообще говоря, перенос энергии от возбужденных молекул в триплетном состоянии является не единственным путем образования синглетного кислорода. Многочисленные исследования позволили выявить ряд элементарных физических и химических процессов, которые могут служить источником 'Ог- В связи с тем, что синглетный кислород играет довольно важную роль в различных фотобиологических процессах, рассмотрим кратко некоторые из этих процессов, представляющие интерес для исследователей биологических систем.



Рисунок 1. Схематическое изображение возможных процессов после поглощения света молекулой сенсибилизатора.


Ps - молекула фотосенсибилизатора; верхний индекс 1 означает, что молекула находится в синглетном состоянии, верхний индекс 3 - в триплетном; индекс * - в возбужденном; х0>2 - синглетный кислород.


А. Перенос энергии на СЬ от триплетных молекул


Процесс генерации ]Ог в результате переноса энергии на кислород от триплетных молекул различных соединений (3Р), по-видимому, является одним из самых эффективных [15]. В результате многочисленных исследований установлено, что этот процесс определяет фотосенсибилизированное образование хОг в растворах разнообразных сенсибилизаторов в аэробных условиях [1]. Тот же механизм должен приводить к появлению хОг в темновых химических и биохимических реакциях, если они сопровождаются образованием возбужденных молекул органических соединений в синглетном и триплетном состояниях (Схема 1).

Как видно из схемы, эффективный перенос энергии от 3Р на Ог возможен лишь в том случае, если энергия 3Р больше энергии синглетных уровней О2. При этом, если энергия 3Р больше энергии !Х+ё, преимущественно должно заселяться именно !?+g состояние. Однако, как указывалось выше, в конденсированной фазе это состояние за десятки пикосекунд переходит в !Ag. Если энергия 3Р меньше энергии ^g, эффективно заселяться может только ^-уровень. Таким образом, образование lAg следует считать основным результатом рассмотренного процесса переноса энергии.


Ро, *Р, 3Р - молекулы сенсибилизаторов в основном возбужденных синглетных и триплетных состояниях соответственно; Е - энергия возбуждения, соответствующая энергии фотонов при фотовозбуждении или энергии химической реакции при возбуждении в ходе химического или биохимического процесса. Одинарный пунктир -межмолекулярный перенос энергии, двойной - внутримолекулярные безызлучательные дезактивационные процессы.

Б. Перенос энергии на О?_от возбужденных синглетных молекул сенсибилизаторов



Прямой перенос энергии на кислород от возбужденных синглетных молекул сенсибилизаторов (!Р) запрещен спиновыми правилами отбора.

Однако, как показал автор работы [15], эти правила разрешают следующий процесс: !Р + О2 П 3Р + !О2 ('^g» ^g)- Из схемы 1. видно, что этот процесс возможен в том случае, если энергетический интервал между 'Р и 3Р больше энергии !?g - или !Ag-уровней Ог. Набор биологически активных соединений с такими параметрами весьма ограничен, и поэтому данный механизм образования JO2 не имеет широкого распространения. Кроме того, эффективность этого механизма, по-видимому, невелика, так как время жизни *Р обычно не превышает 10 не, и поэтому концентрации кислорода в насыщенных воздухом системах недостаточно для эффективного тушения JP. Тем не менее ряд экспериментов свидетельствует о том, что указанный механизм дает заметный вклад в процесс фотосенсибилизированного ароматическими углеводородами образование !О2, особенно при повышенных давлениях кислорода.


В. Генерация ^^перекисью водорода и радикалами *О2~ и НО?' Известно, что перекись водорода, супероксид-анион-радикал *О2~ и его протонированная форма образуются в разнообразных ферментативных и неферментативных процессах в клетках. Имеется информация, свидетельствующая о том, что все эти соединения способны генерировать 'О2. Наиболее подробно исследовано образование 'О2 при реакциях перекиси водорода с NaCIO и газообразным хлором. Первоначально реакцию наблюдали в водных растворах, где она сопровождалась сильной хемилюминесценцией, совпадающей по спектру с излучением 'О2 [17].

Установлено, что аналогичная реакция происходит в живых клетках при взаимодействии ряда ферментов с перекисью водорода и ионами хлора или брома. Наиболее убедительным доказательством образования *О2 в указанном ферментативном процессе является обнаруженная двадцать лет назад хемилюминесценция с максимумом около 1270 нм, возникающая при действии пероксидаз на перекись водорода [18].


Таким образом, склонность молекулы инициировать окислительно-восстановительные реакции и/или генерировать синглетный кислород зависит от способности образовывать достаточное число молекул в триплетном возбужденном состоянии. Это, в свою очередь, зависит от степени распада как триплетного, так и изначально образовавшегося синглетного состояния. Так, например, сильно флуоресцирующая соединение, которое подвергается достаточно быстрому падению из возбужденного синглетного состояния, вряд ли будет образовывать большое количество трип летных возбужденных молекул.


Фотосенсибилизаторы, как правило, ароматические соединения, способные к образованию долго живущих триплетных возбужденных состояний. Энергия, поглощенная ароматической л;-системой, опять же зависит от молекулярной структуры: фуракумариновые


фотосенсибилизаторы (псоралены) поглощают высоко энергетический ультрафиолет (300-500 нм), тогда как макроциклические гетероароматические молекулы, такие как фталоцианины, поглощают более низкий по энергии ближний инфракрасный свет (700 нм) (табл. 1).


При проведении тестирования различных патогенных микроорганизмов на устойчивость к фотодинамической антибактериальной

химиотерапии следует учитывать возможность существования множества субстратов фотоповреждения. Очевидно, что морфология клеток может меняться от образца к образцу, и это будет приводить к различиям в местах локализации сенсибилизатора. Кроме того, время, прошедшее с момента введения фотоагента до начала облучения, также может играть существенную роль: сенсибилизатор, который медленно связывается с клеткой, в первую очередь будет вызывать фотоповреждение клеточной стенки, тогда как после более продолжительной темновой инкубации могут наблюдаться и другие эффекты (например, разрывы в цепочках ДНК).

Мишени действия фотосенсибилизаторов и эффекты фотодинамической инактивации микробных клеток еще будут рассмотрены в данном обзоре. Однако, забегая вперед, проиллюстрируем вышеизложенные предположения на примере родственных фенотиазиниевых красителей толуидиновом синем (ТВО) и метиленовом голубом (MB). В случае фотодеструкции Escherichia coli, ТВО проявляет фотоактивность в первую очередь по отношению к мембране, увеличивая ее проницаемость [19], тогда как действие света на данный микроорганизм в присутствии MB вызывает еще и разрывы в цепочке ДНК, что в итоге приводит к гибели клетки [20].



Механизм фотодинамического воздействия на микробные клетки на молекулярном уровне во многих случаях вполне хорошо установлен. В реакциях типа 1 (рис. 1) сенсибилизатор в возбужденном триплетном состоянии участвует в переносе электрона или атома водорода, в результате чего получаются реакционно-способные радикалы биологического субстрата, вступающие в дальнейшие химические реакции с кислородом или с другими молекулами. В присутствии воды в окружении клетки реакция первого типа может привести к образованию гидроксил-радикалов (ОН»), которые также

Субстраты фотовоздействия Первичные процессы Результат Последующие процессы Цитотоксический эффект


Вода Отрыв водорода Образование гидроксил-радикала (ОН») Образование перекиси водорода и супероксида О2~ Дальнейшие окислительные процессы


Мембранные липиды Отрыв аллильного водорода Образование аллил-радикалов Образование гидропероксидов липидов Нарушение целостности мембраны, увеличение ее проницаемости


Пептиды Отрыв водорода Образование сшивок между полипептидными цепями Инактивация ферментов Потеря репаративных функций; лизис клетки


Вирусная белковая оболочка Окисление тирозиновых, метиониновых, гистидиновых аминокислотных остатков Денатурация белка Потеря инфицирующей способности


Дыхательная цепь Окислительно-восстановительные реакции Ингибирование дыхания


Цитоплазматические или вирусные (обратная транскриптаза) ферменты Окисление или образование сшивок полипептидных цепей Ингибирование рибосомной активности; Ингибирование репликации


Остатки нуклеиновых кислот Окисление основания или сахарного остова 8-гидроксигуанозин Разрывы в цепочке; мутации; ингибирование репликации