shkolakz.ru 1 2 3
mymio_logo.jpg


Неаминогликозидный состав устраняет носенс мутации.

Liutao Du1, Robert Damoiseaux5, Shareef Nahas1, Kun Gao2, Hailiang Hu1, Julianne M. Pollard1, Jimena Goldstine3, Michael E. Jung6, Susanne M. Henning2, Carmen Bertoni4, and Richard A. Gatti1,3

Author Affiliations

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2Center for Human Nutrition, 3Department of Human Genetics, and 4Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, 5Molecular Shared Screening Resources, California NanoSystems Institute, 6Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA 90095

Author Notes

L. Du and R. Damoiseaux contributed equally to this paper.

CORRESPONDENCE Richard A. Gatti: rgatti@mednet.ucla.edu OR Liutao Du: Ldu@mednet.ucla.edu


Введение

Большое количество генетических нарушений вызваны носенс мутациями, для которых состав, индуцирующий преждевременную остановку кодонов (PTC), может быть использован в качестве потенциальной стратегии лечения. Мы успешно разработали чувствительный и количественный высокопроизводительный скрининг (HTS) транскрипции / трансляции (PTT) белка, иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления новых PTC- соединений с использованием атаксии-телеангиэктазии (AT), как генетической модели заболевания. Это HTS PTT-ИФА на основе PTT который использует шаблоны, содержащие плазмиды прототипных AT (ATM) мутаций для HTS. Мы изучили ~ 34 000 соединений и определили 12 низкомолекулярных неаимногликозидных соединения с потенциальной PTC активностью. Из них два ведущих соединения последовательно индуцирующих функциональные белки в ATM-дефицитных клетках, содержащих болезнетворные нонсенс-мутации. Прямые измерения ATM белка показали восстановление ATM киназы. Эти два соединения также продемонстрировали активность в миофибриллах MDX мышей , несущих носенс мутации, и индуцированных значительное количество белка дистрофина.


Об окончании трансляции сигнализируют три кодона: UAA, UAG и UGA. Этот механизм хорошо сохранилися, хотя каждый кодон имеет различную эффективность для завершения трансляции. UGA считается "дырявым" стоп-кодоном с высоким внутренним потенциалом для остановки кодона. UAA показывает высокую точность и малый внутренний потенциал, в то время как UAG имеет промежуточные значения (Weiner и Вебер, 1973. Ловетт и др., 1991). Нонсенс-мутации создают первичную преждевременную остановку кодонов (PTC) и в результате либо не образуется белок или синтезируется усеченный белк с нарушением стабильности.

Некоторые соединения влияют на точность остановки кодона и вызывают первичную PTC, которая позволяет транскрипцию некоторых полных белков. Во многих случаях, вызванный этим событием белок функционален, даже если он содержит ошибочно включенные аминокислоты (Килинг и Bedwell, 2005;. Zingman и др., 2007).

Считается, что 30% человеческих болезнетворных аллелей – это нонсенс-мутации (Менделл и Dietz, 2001). Другие типы мутаций, таких, как смещение рамки считывания и мутации сплайсинга, приводят к вторичной PTC , однако, это не может быть мишенью для терапевтических целей. Учитывая, что> 1800 различных генетических нарушений вызвано нонсенс-мутациями, первичная PTC имеет потенциал для лечения большого количества больных.

На сегодняшний день большинство из соединений, вызывающих PTC, которые активны в клетках млекопитающих, принадлежали к классу аминогликозидов (Килинг и Bedwell, 2005;. Zingman и др., 2007). Некоторые виды аминогликозидов могут помочь рибосомам прочитать мутации через вставки случайной аминокислоты. Терапевтический потенциал аминогликозидов был оценен в лаборатории для различных генетических моделей, таких как кистозный фиброз (Howard и др., 1996;. Bedwell и др., 1997;.. Ду и др., 2002), мышечная дистрофия (Howard и др.. , 2000; Вагнера и др., 2001;. Дюнан и др., 2003;. Loufrani и др., 2004), Hurler синдром (Килинг и др., 2001), цистиноз (Helip-Вули и др., 2002), спинальная мышечная... атрофия (Sossi и др., 2001)., атаксия-телеангиэктазии (AT,. Лай и др., 2004), и тип 1 синдрома Ушера (Rebibo-Саббах и др., 2007.). Клинические исследования также показывают, что аминогликозиды могут вызывать некоторое производство функционального белка, но терапевтический эффект остается неопределенным (Wilschanski и др., 2000;. Clancy и др., 2001;. Вагнер и др., 2001;.. Politano и др., 2003).


Кроме того, токсичность большинства коммерческих аминогликозидам у млекопитающих значительно снижает их потенциал для успешной терапии (Mingeot-Леклерк и Тюлькенс, 1999; Гуан и др., 2000.). Таким образом, предпринимаются усилия по разработке производных аминогликозидов с пониженной токсичностью и повышенной активностью (Нудельман и др., 2006;.. Rebibo-Саббах и др., 2007). В последнее время PTC Therapeutics (Южная Plainfield, Нью-Джерси), описала более эффективное неаминогликозидное соединение PTC124, которое было разработано синтетическим путем скрининга> 800 000 химических веществ и аналогов с помощью люциферазы на основе высокопроизводительного скрининга (HTS) (Welch и соавт., 2007 ; Hirawat и др., 2007;. М. Ду и др., 2008)..Фазы-I клинических исследований при муковисцидозе подтвердила, что PTC124, как правило, хорошо переносится и, как представляется, более эффективен, чем аминогликозиды (Hirawat и соавт., 2007). Кроме того, PTC124 не вызывает рибосомных эффектов, нормализует остановку кодонов. Фаза-II клинических испытаний ведется в настоящее время (Керем и соавт., 2008). Однако, недавнее исследование показывает, что начальные открытие PTC124 может быть предвзятым.

В попытке открыть для себя новые соединения, мы разработали чувствительный и количественный независимый анализ HTS транскрипции / трансляции белка (PTT). PTT-ИФА была разработана для автоматизированной 384-а платформы и используется для скрининга ~ 34 000 соединений. Мы сосредоточили усилия на последующих 12 низкомолекулярных неаминогликозидных соединенях. Оттуда, мы определили два соединения, индуцирующих низкий уровень полного функционального белка во всю длинну в клетках, несущих AT нонсенс-мутации, как показали прямые измерения ATM белка с использованием ATM-ИФА, ATM-Ser1981 аутофосфорилирования, транс-фосфорилирования структур хромосомы (SMC) 1-Ser966 и анализа выживания колонии. Оба соединения также показали активность в отношении миофибрилл MDX мышей, несущих носенс-мутации, и индуцировали значительное количество белка дистрофина.


В совокупности эти исследования дают первые надежные подтверждения надежности независимого HTS анализа для выявления таких соединений и доказывают принцип PTC для неаминогликозидных соединений. Они также устанавливают, что расширение возможностей PTC можно рассматривать как терапевтическую стратегию для исправления нонсенс-мутации при многих генетических заболеваниях.


Результаты

Разработка и утверждение HTS анализа

In vitro PTT был первоначально разработан для обнаружения мутаций (Roest и др., 1993;.. Telatar и др., 1996). ИФА использовалось в сочетании PTT чтобы улучшить пропускную способность для выявления этих мутаций (Gite и др., 2003;.. L. Du и др., 2008). В предыдущем исследовании мы использовали PTT- в геле для оценки различных аминогликозидов по воздействию на нонсенс-мутации (Lai и соавт., 2004). Тем не менее, анализа PTT в геле занимал много времени и связан с использованием радиоактивных материалов, поэтому было сложно автоматизировать его для высокой пропускной способности. При этом, мы разработали плазмиды для PTT-ИФА для скрининга большого числа соединений PTC. Анализ использует шаблоны, содержащие плазмиды прототипных мутаций AT, по образцу конкретных болезнетворных мутаций AT. Так как требовалась работа в клетках млекопитающих, были выбраны ретикулоциты кролика для управления реакцией PTT. Различные фрагменты мутировавших аллелей из клеток больных АТ были клонированы в плазмиды с N-и С-терминальной меткой эпитопов myc и V5, соответственно. Anti- myc антитела использовались для получения перевода белка на пластины ELISA. Если соединения вызывают PTC в анализе, в полнометражных ATM фрагмент включался V5, которая обнаруживается антителами анти-V5-пероксидазой хрена (HRP) (рис. 1).


Мы построили три мутантные плазмиды, содержащие прототипные мутации в АТ гене от трех разных больных АТ. Плазмиды используются для предварительного отбора, плазмиды TAT51, содержит ATM области 5 фрагмент (кодонов 1403-1886) и таит в себе носенс- мутацию (c.5623C → T), что приводит к остановке кодона TGA. Вторая плазмиды AT153LA содержит тот же стоп-кодон TGA, но на другой позиции внутри гена (c.8977C → T) в области 8 (кодонов 2550-3050). Она была использована для мониторинга влияния окружающей последовательности на PTC способности. Третья мутантная плазмида AT185LA, содержит различные стоп-кодоны, TAA G, в результате нонсенс мутации (c.3673C → T) в области 4 (кодонов 1041-1531). Плазмиды, содержащие те же фрагменты, но без мутаций были построены в пробирке мутагенезом производных комплементарной ДНК пациентов и были использованы в качестве дикого типа контроля.mymio_logo.jpg


Сначала мы оценивали специфичность и чувствительность PTT-ИФА для определения в пробирке трансляции полнометражного фрагмента белка. Все три мутантные плазмиды дали только фоновый сигнал, в то время как сопоставимые плазмиды дикого типа показали сигналы больщее ~ 200 раз по сравнению с фоном (рис. 1, б, вверху), что указывает на специальность фрагментов белка. Затем мы использовали TAT51 плазмиду дикого типа для оценки чувствительности анализа. TAT51 дикий тип плазмиды серийно разбавляют TAT51 мутантной плазмидой и используется для управления PTT реакцией. Образцы, содержащеие 1,2% дикого типа плазмид (2/158 нг) дали сигнал, который был вдвое выше, чем у мутантных плазмид (рис. 1, б, внизу), установив чувствительность теста ~ 1%.Чувствительность анализа HTS особенно важная для скрининга РTC , потому что все RTC на сегодняшний день были только слабыми PTC индукторами, и новые классы RTC должны быть определены высоко чувствительным скринингом.

Далее, мы использовали два известных RTC, G418 и гентамицин, чтобы проверить эффективность PTT-ИФА. Оба соединения показали значительную PTC деятельность с TAT51 мутантной плазмидой (TGA C) в широком диапазоне доз (40 нм-10 мкм;. Рис. 1 в). Кроме того, G418 показал очевидную токсичность в реакции PTT при концентрации> 2,5 мкм, в то время как токсичность гентамицина не наблюдалось до 12.5 мкм. Эти результаты согласуются с нашими ранее опубликованными данными S35-PTT в геле (Lai и соавт., 2004) и показали, что PTT-ИФА легко идентифицирует соединения с РTC активностью. mymio_logo.jpg

Далее проверки анализа для использования в полностью автоматизированной 384-а платформы, с помощью плазмиды-TAT51 (TGA C) в качестве шаблона и 1 мкМ G418 в качестве положительного контроля. Чтобы еще больше снизить затраты на анализ, мы оптимизировали уменьшение объема PTT реакции с 25 до 5 мкл. Как показано на рис. 1 D, G418 показали значительные различные сигналы (фактор Z '> 0,8) по сравнению с контролем.


Скрининг химических соединений

Около 34000 соединений были исследованы, чтобы открыть новые RTC. Плазмида-TAT51 (TGA C) была использована для первоначальной проверки. Каждое соединение был в конечной концентрации 10 мкМ в анализе смеси. Для каждого исследования, мы брали как положительные (с 1 мкМ G418) так и отрицательные (с ДМСО) образцы контроля качества. Наш первоначальный скрининг дал 12 низкомолекулярных RTC с заметной активностью. Все 12 соединений были подтверждены ручной PTT-ИФА на разных концентрациях (химические названия приведены в таблице S1). Все из них были неаминогликозидными и ни о ком из них не сообщалось ранее. Химические названия и структуры двух ведущих соединений, RTC № 13 и № 14, представлены на рис. 2, названия и структуры для оставшихся 10 RTC приведены на рис. S1 и таблицы S1.



EC50 из пяти соединений (RTC # 4, # 11, # 13, # 14 и # 16) было <10 мкм (рис. 2, б, RTC № 13 и № 14), подразумевая, терапевтический потенциал этих соединений. Примечательно, что в этих первых клетках без экспериментов, максимальный эффект в пробирке для нового соединения не был столь благоприятным, как и у G418 или гентамицина. Например, максимальная активность № 13 и № 14, обнаружены в клетках PTT-ИФА, составила ~ 10% от максимальной активности G418 и гентамицина в том же тесте (рис. 1в по сравнению с рис 2. б). Это может быть связано с растворимостью, проницаемостью, или токсичностью соединений. В отличие от этого, RTC # 13 и # 14 были EC50 <10 мкм, они менее токсичны, и они не показывают очевидного торможения PTT при высокой концентрации (> 50 мкм), в отличие от G418 и гентамицина (рис. 1С ).

Эффективность этих соединений была также протестирована на двух других стоп-кодонах, TGA и ТАА G. Для TGA, все 12 соединений показали, различную степень деятельности (неопубликованные данные). Для ТАА G, и шести соединений (RTC # 10, # 11, # 13, # 14, # 16 и # 17) показали заметную активность (неопубликованные данные). Данные для RTC № 13 и № 14 на рис. 2 с.


RTC -индуцированный AT белок и ATM-Ser1981 фосфорилирование в AT лимфобластоных клеточных линиях (LCLS)

Чтобы проверить возможность вновь выявленных соединений вызвать синтез ATM белка в клетках с AT мутациями PTC, мы обработали AT LCLS каждым соединением в течение 4 дней до уборки клеток. Вестерн-блотт анализ ядерных лизатов в целом недостаточно чувствителен для мониторинга ATM белка (Lai и др., 2004.), Поэтому мы использовали ATM-ИФА метод измерения внутриядерных белков в клетках (Butch и др., 2004). . Концентрации отдельных RTC, используемых для лечения AT153LA LCL с гомозиготной TGA мутацией были основаны на их цитотоксическом профиле (рис. S2, RTC № 13 и № 14). Клетки обрабатывали высокими концентрациями RTC, > 70% жизнеспособности по сравнению с необработанными клетками. RTC # 13 и # 14 последовательно индуцировали низкий, но заметный уровнь ATM белка в AT LCLS (рис. 3). Восстановленная ATM белка составило ≤ 5% от дикого типа LCLS. Гентамицин и G418 также индуцирует небольшое количество белка ATM (рис. 3). Мы были воодушевлены этими результатами, потому что у некоторых пациентов с остаточным синтезом белка может произойти существенное увеличение активности киназы ATM, и это связано с поздним началом и медленным прогрессированием симптомов (Гилад и др., 1998;.. Чун и др. 2003). Таким образом, мы считаем, что даже незначительное повышение белка обладают терапевтическим потенциалом.


Для оценки функции RTC -индуцированного белка ATM, мы измеряли вызванные облучением очаги (IRIF) ATM-Ser1981 в тех же AT153LA клетках (TGA). В клетках не образуются очаги после ионизирующего излучения (ИИ) ATM-Ser1981, потому что белки либо отсутствуют, либо функционально нарушены (обычно бывшей). Мы обнаружили, что RTC # 13 и # 14 индуцировали значительное количество Ser1981 IRIFs в AT клетках TGA, тогда как только фоновый уровень IRIF наблюдался в необработанных контрольных образцах (рис. 3 б). В то же время, ~ 51% от дикого типа клеток показали, различные очаги. Максимальная индукция IRIF достигнута в AT клетках 10 мкм RTC # 13 было ~ 40% дикого уровня. В качестве положительного контроля, 144 мкМ G418 (100 мкг / мл) был использован для лечения клеток. Наши предыдущие исследования показали, что при такой концентрации, G418 вызывали максимальный уровень ATM1981 IRIF (Lai и соавт., 2004). Как и ожидалось, значительная IRIF была вызвана в G418-обработанных клетках. Уровень в AT клетках составляет примерно половину от клеткок дикого типа. Соединения были также протестированы в другой AT клеточной линии, AT229LA, с гомозиготной TAG мутацией, и оба RTC # 13 и # 14 индуцировали значительное число Ser1981 IRIF, по сравнению с необработанными AT клетками (рис. 3с).


Для дальнейшего сравнения деятельности RTC № 13 и № 14 с гентамицином и G418, мы использовали проточную цитометрию (FC) на основе анализа ATM-Ser1981 фосфорилирования для оценки активности в клетках AT229LA (TAG;. Рис. 4). Оба RTC # 13 и # 14 индуцировали увеличение ATM-Ser1981 аутофосфорилирования, о чем свидетельствует сдвиг вправо интенсивности флуоресценции (FI). Это согласуется с предыдущими ATM IRIF данными (рис. 3в). Обнадеживает тот факт, что ATM-Ser1981 фосфорилирование индуцированных RTC # 13 и # 14 было аналогично тем, индуцированным одними и теми же концентрациями гентамицина и G418 в одной клеточной линии (рис. 4). Ни одно из двух соединений не дает зеленой флуоресценции (изотипа контроля;. Рис. 4, правая верхняя гистограмма). Подобные эффекты наблюдались также в клетках AT153LA (TGA) с помощью цитометрии на основе анализа ATM-Ser1981 фосфорилирования (неопубликованные данные). mymio_logo.jpgmymio_logo.jpg




следующая страница >>