shkolakz.ru 1 2 ... 6 7


ДЕРМАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОЖИ

Зорин В.Л.1,2, Зорина А.И.1, Петракова О.С.1, Черкасов В.Р.1

1 ООО «Биотехнологическая компания»

2 НИИ Канцерогенеза РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН


Ключевые слова: аллогенные и аутологичные фибробласты; регенерация тканей; заживление ран; имплантационные материалы; кожные трансплантаты; обзор рынка.


Резюме

Лечение дефектов кожи с использованием культивированных in vitro клеток получило широкое признание во всем мире, как безопасный и эффективный метод. Среди множества типов клеток, способных оказывать клинический эффект, особый интерес вызывают дермальные фибробласты, которые представляют собой гетерогенную популяцию клеток мезенхимного ряда и играют ключевую роль в процессах регуляции клеточных взаимодействий и поддержании гомеостаза кожи. Фибробласты не только формируют оптимальные условия для функционирования и пролиферации других типов клеток (эпителиальных, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), но и отвечают за координацию их функций в соответствии с расположением на теле. Способность фибробластов формировать межклеточный матрикс, синтезировать цитокины, вызывать миграцию и пролиферацию разных типов клеток при повреждениях кожи делает их перспективными для широкого клинического применения. В данном обзоре представлены описание свойств и функций фибробластов, опыт клинического применения, перечислены используемые для лечения повреждений кожи коммерческие препараты.


Abstract

Therapy of skin defects by in vitro cultivated cells acquired a world-wide recognition as a safe and efficient method. Among a great number of clinically efficient cells the dermal fibtoblasts – a heterogenic population of mesenhyimal cells playing a key function in the control of cell interaction and a skin homeostasis – are of particular interest. The fibroblasts form the optimal conditions for functioning and proliferation of other cells (epithelial, endothelial, hair follicles) as well as are responsible for coordination of their functions according to position in the body.


The fibroblast ability to form intercellular matrix, to synthesize cytokines and to provoke migration and proliferation of cells of different types under skin damage make them a promising tool for broad clinical applications.

The current review contains description of the properties and functions of fibroblasts, the best clinical practices of their application. Commercially available products for treatment of skin damage are also discussed.


Введение

В связи с успехами в области клеточных технологий и началом их применения в клинической практике получило активное развитие новое направление в медицине – клеточная терапия. Среди наиболее перспективных и успешных областей использования культивированных клеток можно особо выделить лечение повреждений кожи посредством дермальных фибробластов, которые, благодаря своей эффективности и относительно небольшой себестоимости, прочно заняли определенную нишу.

Роль фибробластов в регенерации тканей

Фибробласты – одни из основных секреторных клеток организма, участвующие в формировании внеклеточного матрикса, репарации повреждений кожи, стимуляции роста кератиноцитов и сосудов. В соответствии со своим расположением в ткани и выполняемыми функциями фибробласты способны продуцировать проколлаген, фибронектин, гликозаминогликаны, проэластин, нидоген, ламинин, хондроитин-4-сульфат, тинасцин [1,2]. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас ткани, гликозаминогликаны и фибронектин составляют ее межклеточный матрикс, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток в ткани [3,4].

Фибробласты участвуют в формировании базальной мембраны кожи посредством синтеза коллагена I и III типов, ламинина-1, нидогена, цитокинов, стимулирующих кератиноциты к синтезу компонентов базальной мембраны: коллагена IV и VII типов, ламинина 5, перликана [5,6,7]. Данные клетки также продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста, оказывающие аутокринный и паракринный эффекты.


Аутокринный эффект обеспечивается секрецией ряда ростовых факторов, в частности, фактором роста соединительной ткани, синтез которого, в свою очередь, стимулирует трансформирующий ростовой фактор TGF-бета. TGF-бета также стимулирует хемотаксис фибробластов и продукцию ими коллагена и фибронектина [8]. Фактор роста соединительной ткани стимулирует синтез коллагена и пролиферацию фибробластов [9].

Паракринный эффект обеспечивается секрецией фактора роста кератиноцитов (KGF), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста колоний гранулоцитов-макрофагов, интерлейкина (IL)-6, фактора роста фибробластов (FGF)-10 [10,11,12]. В свою очередь, кератиноциты синтезируют IL-1, который стимулирует фибробласты к синтезу KGF, образуя, таким образом, стройную систему взаимно стимулирующих положительных обратных связей [13,14]. El Ghalbzouri A. еt al. [15] показали, что кератиноциты в культуре образуют тонкий эпидермальный слой и без поддержки мезенхимных клеток подвергаются апоптозу через две недели культивирования. В опытах по выращиванию кератиноцитов на коллагеновом геле, содержащем фибробласты, обнаружено, что фибробласты кожи не только стимулируют пролиферацию кератиноцитов, но и способствуют развитию слоев кожи – базального, шиповидного, зернистого и рогового.

Паракринная активность фибробластов выражается также в стимуляции образования кровеносных и лимфатических сосудов за счет секреции семейства факторов роста эндотелия сосудов (VEGF), в частности, VEGF-A, -B, -C, -D [16]. Ростовые факторы VEGF-A и, в меньшей степени, VEGF-В влияют на ангиогенез за счет активации эндотелиальных клеток-предшественников. VEGF-С стимулирует ангиогенез, VEGF-D – образование лимфатических сосудов за счет воздействия на рецепторы [Error: Reference source not found, 17]. При совместном культивировании на коллагеновом геле эндотелиальных клеток и дермальных фибробластов с избыточной экспрессией VEGF-С была выявлена активация эндотелиальных клеток и повышение уровня экспрессии матриксной металлопротеиназы 1, благодаря чему эндотелиальные клетки обретают способность разрушать окружающий коллаген, образовывать капилляроподобные разветвленные структуры и мигрировать в геле [Error: Reference source not found].


Стимулирующее влияние на ангиогенез выявлено также у трансформирующего фактора роста (TGF)-альфа. Ростовой фактор TGF-бетта-1 оказывает воздействие на ангиогенез посредством стимуляции синтеза VEGF-B, -C, -D [Error: Reference source not found,18]. Основной фактор роста фибробластов (bFGF) ускоряет рост и миграцию эндотелиоцитов, что может быть связано со способностью bFGF контролировать синтез компонентов межклеточного матрикса, которые воздействуют на экспрессию генов [19].

Фибробласты – гетерогенная клеточная популяция, уровень экспрессии генов которой зависит не только от расположения в ткани [Error: Reference source not found,20] и выполняемых функций [21,22], но и от расположения на теле [23,24]. Фибробласты взрослого человека сохраняют характерный для эмбриональных клеток НОХ код, который представляет собой образец экспрессии генов, относящихся к семейству транскрипционных. В период эмбриогенеза экспрессия специфических генов НОХ определяет различную позиционную идентичность, что приводит к сайт-специфической клеточной дифференцировке и тканевому морфогенезу. Анализ экспрессии генов 47 популяций фибробластов из 43 анатомических участков тела взрослого человека показал, что все разнообразие фибробластов обусловлено их происхождением из разных участков тела, принадлежащих к одному из трех анатомических отделов: передне-заднему, проксимально-дистальному или дермально-недермальному. Например, гены НОХВ (HOXB2, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7 и HOXB9) экспрессируются в ограниченном количестве в дермальных образцах из туловища и недермальных образцах, тогда как HOXD4 и HOXD8 экспрессируются исключительно в образцах из туловища и ног. Это соответствует роли данных генов в установлении переднее-задней оси тела и формировании тела и легких в течение процесса эмбриогенеза. НОХА13, регулирующий развитие дистальных элементов в процессе эмбриогенеза, экспрессируется исключительно в фибробластах взрослого человека, полученных из дистальных участков тела (стопа, пальцы, крайняя плоть). Данный механизм обеспечивает наличие у фибробластов эпигенетической памяти, которая несет информацию о расположении ткани на теле и о специфичности выполняемых ими на данном участке функций [Error: Reference source not found]. Транскрипционный образец остается стабильным даже после серии пассажей in vitro, что свидетельствует о том, что дифференцированные фибробласты имеют мощные механизмы, ответственные за поддержание своей эпигенетической информации. Происхождение дермальных фибробластов определяет фенотипический профиль и расположенных над ними кератиноцитов [25]. К примеру, при совместном культивировании фибробластов из биоптата кожи ладоней и подошв с кератиноцитами, полученными из других областей, кератиноциты начинают экспрессировать кератин 9 и формировать более толстый эпидермис, что для них не характерно [26]. Представленные данные свидетельствуют о том, что место биопсии необходимо выбирать с учетом анатомического расположения участка кожи, нуждающегося в клеточной терапии.


Фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран [27]. Заживление ран включает в себя несколько фаз, среди которых можно выделить следующие: воспаления, грануляции, эпителизации и, в случае неполной эпителизации, образования рубца. Начиная с первой фазы запускается каскад реакций взаимодействия кератиноцитов с фибробластами, в результате которых происходит миграция клеток от края раны по раневому ложу перпендикулярно его краям, пролиферация клеток края раны или вблизи него и пролиферация новообразованного эпителия, мигрировавшего к центру раны. В итоге, формируется эпителий с характерными признаками, свойственными нормальному эпителию данного участка кожи [28]. В случае повреждения ткани одними из первых регуляторных факторов синтезируются KGF/FGF7, которые связываются с FGFR2IIIb-рецептором на кератиноцитах [Error: Reference source not found,29]. В случае больших повреждений ткани наблюдается дифференцировка фибробластов в миофибробласты (начиная с фазы грануляции), чему способствуют механические воздействия и активность TGF-бетта [30,31]. Миофибробласты характеризуются измененным синтезом фибронектина и гликозаминогликанов, повышенным синтезом TGF-бетта 1, TGF-бетта 2, коллагена I типа и рецептора IGF-II/манноза 6-фосфата [32]. Миофибробласты вызывают перерождение кератиноцитов [33,34,35], что способствует склерозу тканей и образованию рубцов [36,37].


Выделение и культивирование фибробластов in vitro

Активные попытки использовать культивированные фибробласты в медицинской практике стали предприниматься после того, как было установлено, что дермальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип, имеют ограниченную продолжительность жизни [38], не экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости класса II, не проявляют онкогенных свойств [39]. Фибробласты получают из биоптатов кожи посредством ферментативной обработки или механической дезагрегации образцов. В настоящее время наиболее часто используют ферментативный способ получения первичной культуры. Для этого биоптат промывают физиологическим раствором или фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотики, обрабатывают раствором фермента коллагеназы и/или трипсина. Затем, осторожно пипетируя, клетки освобождают от матрикса, осаждают центрифугированием, отмывают от ферментов и, ресуспендируя в культуральной среде, культивируют в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе.


Получаемая клеточная популяция – гетерогенна, так как выделенные фибробласты находятся на разных стадиях развития (небольшие веретеновидные активно делящиеся клетки-предшественники; более крупные веретеновидные созревающие клетки; крупные плащевидные зрелые фиброциты) [40]. Кроме того, различают фибробласты сосочкового, ретикулярного слоев дермы и фибробласты, ассоциированные с волосяным фолликулом. Каждый тип фибробластов имеет свои особенности: фибробласты сосочкового слоя, по сравнению с фибробластами ретикулярного, делятся с большей скоростью, их рост не полностью ингибируется контактным торможением. Фибробласты ретикулярного слоя быстрее растут на подложке из коллагена I типа. Фибробласты сосочкового слоя синтезируют протеогликан декорин, в то время как для ретикулярных фибробластов характерен синтез версикана. По синтезу коллагена I и III типов дермальные фибробласты значительных различий не имеют [Error: Reference source not found].

Иммунофенотипический профиль культивируемых фибробластов кожи в норме соответствует профилю клеток мезенхимного ряда. Фибробласты имеют высокий уровень экспрессии виментина, молекул адгезии (CD44, СD49b, CD54, CD90, CD105), не экспрессируют маркеры прогениторных, гемопоэтических (CD34, CD45, CD133, CD117, HLA-DR, нестин) и эндотелиальных (фактор фон Виллебранда, CD106) клеток [41,42].

На скорость роста и свойства фибробластов в культуре оказывают влияние следующие факторы: количество пассажей, способ культивирования, тип используемых сред и сывороток, возраст донора, область проведения биопсии. Показано, что для культур, полученных от пожилых доноров, скорость удвоения клеточной популяции снижена, наблюдается более быстрое старение клеточных культур, количество клеток в них на момент образования монослоя на 50% меньше, чем у молодых. Это связано с тем, что в клеточных культурах, полученных от пожилых доноров, преобладают более крупные зрелые дифференцированные фибробласты [43].


Для определения пролиферативного потенциала клеточной культуры используют понятие эффективности клонирования, которая представляет долю клеток, способных образовывать колонии из 16 и более клеток в течение 18 дней. Эффективность клонирования в значительной степени зависит от таких факторов, как условия культивирования, количество пассажей, тип используемой сыворотки и, при одинаковых условиях, она является очень точной и воспроизводимой характеристикой штамма клеток. Эффективность клонирования тканеспецифична и, по всей видимости, имеет генетическую предопределенность, так как является постоянной для данного организма и имеет незначительную корреляцию с возрастом донора. Для дермальных фибробластов эффективность клонирования в процессе культивировании плавно нарастает, достигая максимума на 5 пассаже, затем образуется плато и последующий спад. Такие изменения связаны с кинетикой роста фибробластов: к пятому пассажу постепенно увеличивается доля активно делящихся клеток в силу их селективного преимущества, затем наблюдается постепенное исчерпывание их пролиферативного потенциала. Для фетальных штаммов фибробластов эффективность клонирования находится в пределах 38-82%, для постнатальных штаммов – 12-60% [44].

Считается, что из аллогенных фибробластов наибольшей клинической эффективностью обладают эмбриональные фибробласты, которые имеют больший пролиферативный потенциал по сравнению с клетками постнатальных культур. Однако применение эмбриональных клеток имеет ряд ограничений, в том числе этического характера. В то же время показано, что фибробласты от пожилых доноров сохраняют свой терапевтический потенциал, не теряют способность делиться и продуцировать коллаген I типа, несмотря на уменьшение их числа и эффективности клонирования в стареющем организме [Error: Reference source not found]. Cristofalo V.J., et al. [45], проанализировав клетки кожи 124 здоровых доноров, показали, что продолжительность жизни фибробластов в культуре не коррелирует с возрастом пациента. Также показано, что пролиферативный ответ культивируемых фибробластов на стимуляцию цитокинами и способность синтезировать коллаген и неколлагеновые белки после стимуляции FGF не зависят от возраста донора клеток [46].



следующая страница >>